Publikálva:

 

Lőrincz, A. – Neményi, M. (2002): Az in vitro sejtfeltárás hatékonyságát befolyásoló fizikai tényezők (2. rész). Laboratóriumi Információs Magazin, Biofizika rovat. XI. évfolyam, No. 2. pp. 36-38.

 

Az in vitro sejtfeltárás hatékonyságát befolyásoló fizikai tényezők

 

Felhasznált anyagok és módszerek

 

A felhasznált anyagok és eszközök három csoportra bonthatóak A, az alkalmazott kezelő berendezések, B, vizsgált szuszpenzió és C, a detektálási rendszerek, melyeket az 1. ábra mutat sematikusan.

1.    ábra: A felhasznált anyagok és eszközök: A.1., A.2. ultrahang frekvencia generátor és erősítő, A.3. ultrahang rezonátor, A.4. termosztát, A.5. analitikai mérleg, B. kísérleti szuszpenzió, C.1. audio detektor egység, C.3. biológiai detektor egység.

 

Az 1. ábrán látható műszerek és berendezések részei az „A.1.” ultrahang frekvencia előállító készülék, melynek jelgeneráló egysége szinusz jelformát állít elő, 1 [kHz] – 16 [MHz] frekvencia tartományban, mely 1 [kHz] frekvencia tartományonként történő manuális frekvenciaállítási lehetőséget biztosít. A készülék az aktuálisan alkalmazott frekvencia értéket egy monitor egységen jelzi ki. Az „A.2.” ultrahang erősítő, főleg a megahertzes frekvencia tartományokra tervezett, de 100 [kHz] – 2 [MHz] frekvencia tartományban viszonylag jó közelítéssel lineáris, azonos mértékű erősítési szintet ad. Az 50 [Ω] impedancia érték mellett 0-40 [W] erősítést tesz lehetővé, valamint az erősítés mértékét egyenfeszültségben adja meg, melyet kalibrációs görbe segítségével és a sugárzási felület ismeretében [W/cm²] értékre tudunk vonatkoztatni. A vizsgálatainkban folyamatos hullám (CW) módot alkalmaztunk, a célszerűen tervezett rezonátorunkból adódóan legfőbbképpen longitudinális hullámformát előállítva. A rezonátor kialakítása kiválóan alkalmas az álló és a haladó sík hullámok kialakítására, így a szuszpenzióban található részecskék célirányos manipulációjára, illetve inaktiválására is. 

 

A tömeg mérésére az 1. ábrán „A.4.” jelzésű analitikai mérleget alkalmaztuk. A besugárzott szuszpendáló anyagként „B” 0,5-1 órán át, pihentetett, 20 [ºC] hőmérsékletű csapvizet alkalmaztunk, szuszpendált anyagként liofilizált Saccharomyces cerevisiae élesztőt használtunk. Az alkalmazott detektálási rendszerek „C” több módszer eszközeit foglalják magukban, ezzel kapcsolatban megkülönböztethetjük a „C.1.” audio, „C.2.” vizuális és a „C.3.” biológiai detektálási módszerek eszközeit és berendezéseit. Az audionális módszer eszközeinek „C.1.” alkalmazásával cél főleg a tranziens kavitáció jellegzetes sziszegő, pattogó hangjának detektálása audionális módszerekkel, melynek fő részei a mikrofon és oszcilloszkóp. A „C.2.” vizuális módszer azt jelenti, hogy a szemmel követhető hullámjelenségeket, a kezelési idő függvényében folyamatosan nyomon kísérjük, ami például az álló hullám, vagy a gomolygó áramlás, vagy a folyadék sugár kialakulása lehet, a tapasztalt jelenségeket az idő függvényében pedig dokumentáljuk. A „C.3.” biológiai módszer a vitális festés metilénkék festékkel. Célunk a módszer felhasználásával az ultrahang hatására a mikroorganizmusok életképességében beállt változások megfigyelése az alkalmazott kezelési idő függvényében. Az adatrögzítést a biológiai mikroszkópból egy CCD kamerán keresztül beérkezett kép számítógépes file formátumba történő rögzítése biztosítja.

            A kezeléseket 1,117 [MHz] frekvencián 9 [W/cm²] ultrahang teljesítmény mellett végeztük 20 [˚C] hangtér hőmérséklet mellett 20 [ml] sejtszuszpenzió jelenlétében, 3,2 illetve 7,04 [g/l] sejtkoncentráció + 3 csepp 1 % koncentrációjú metilénkék oldat mellett. A kezelési idő során 15 másodpercenként 0,02 ml szuszpenzió mintát vettünk ki automata pipettával steril pipetta heggyel egy-egy mikroszkóp tárgylemezre, amelyekből később, egy időponthoz tartozó több látótér leszámolásának átlagaként kaptuk meg az egy időponthoz tartozó relatív sejtszám értékeket, amit azután táblázatos, illetve grafikonos formában kiértékeltünk. Ezután vettük fel a különböző szuszpenzió koncentrációkhoz tartozó túlélési görbéket. A kísérletek folyamán, a hangtérben műszeresen és érzékszervileg tapasztalt hullámjelenségeket szintén az idő függvényében dokumentáltuk, majd végül az eredményeket összevetettük.

 

Eredmények és értékelésük

           

A 3. ábrán a jellemző kiindulási állapot látszik, ahol megfigyelhető, hogy a sejtek legnagyobb hányada vitalitást tükröz, nem színeződött és az élesztőre jellemző morfológiájú. A 4. ábrán a kezelés alatti állapot látható, ahol már a sejtek egy része a kezelés hatására elpusztult, lyukas, festődött, a citoplazma és a sejtszervek nagy része az extracelluláris térbe áramlottak. Az 5. ábrán pedig a kezelés végső stádiuma figyelhető meg, ahol az alkalmazott módszer alapján kimondható, hogy az összes sejt elpusztult.

Forrás: Lőrincz Attila, 2001’

2.    ábra: kezelés előtti kiinduló állapot

 

 

Forrás: Lőrincz Attila, 2001’

3.    ábra: kezelés alatti állapot

 

 

Forrás: Lőrincz Attila, 2001’

4.    ábra: a sejtek inaktiválódása után, a kezelés végső stádiuma,

 

A két különböző sejtkoncentráció (3,2 illetve 7,04 [g/l]) mellett tapasztalt túlélési dinamika a 6. ábrán figyelhető meg (1. táblázat). Jól látszik a két különböző koncentrációhoz tartozó túlélési görbe közti különbség. Az alacsonyabb sejtkoncentrációhoz tartozó görbe exponenciális túlélési dinamikát mutat. A második, magasabb sejtkoncentrációjú szuszpenzió esetében azonban három szakaszt különíthetünk el a túlélési görbében. Az első szakasz (I) a relatív sejtszám gyors csökkenését mutatja, ahol a haladó hullám dominál, erős sugárnyomás érvényesül a hangtérben a szemcsék magas szintű adszorpciója miatt, kavitáció nélkül. Ebben a szakaszban is csökken a sejtek vitalitása, ezt a szakirodalom is megállapítja. A második szakaszban (II) a sejtszám csökkenésének megtorpanása jellemző, ami az állóhullám felépülésének köszönhető. A szuszpendált szemcsék jól megfigyelhetően az állóhullám nyomási csomósíkjaiban stabilizálódnak. A harmadik szakaszban (III), az állóhullám hatására létrejött szemcse aggregáció miatti szedimentáció hatására részlegesen letisztult hangtérben az ultrahang adszorpció csökkenésének hatására megnövekvő akusztikus nyomás amplitúdó miatt megindul a kavitáció, melynek zaját detektáltuk. Ebben a szakaszban már szintén exponenciális túlélési dinamika érvényesül. A hangtér letisztulása, a kiülepedés miatt nem okoz nagymértékű sejtvédő hatást a kavitációval szemben, mivel a kavitáció intenzív hangtérbeli folyadékáramlást indukál, amely hatására a sejtek kavitációs buborékkal történő találkozása biztosított, így folyamatosan megtörténik az inaktiválódás.  Az 7. ábrán, a két különböző kiinduló sejtkoncentrációjú szuszpenzió túlélési görbéi látszanak. Megfigyelhető, hogy a két különböző sejtkoncentrációhoz, sőt a magasabb kiinduló koncentrációjú szuszpenzióban kialakuló eltérő jelenségekhez is, különböző „D” értékek tartoznak (2. táblázat). Az egyes jelenségek úgy hatnak, mintha nem ugyanazt a kezelést kapná a két minta. Ez azért van, mivel a különböző sejtkoncentrációk hatására más-más jelenségek jutnak érvényre a hangtérben, melyek a most tárgyalt sejtkárosító hatáson túl egyéb hatásokat is kifejtenek a szuszpendált részecskékre. Az alapanyag 5,6*10⁹ /g kiinduló sejtszámú.

1. táblázat: túlélő sejtszámok alakulása az idő függvényében

 

 

5. ábra: túlélő sejtszámok alakulása az idő függvényében

 

6. ábra: a különböző kiinduló koncentrációkhoz tartozó túlélési görbék

 

 

 

2. táblázat: tizedelődési idők a különböző szuszpenzió koncentrációk és az eltérő hangtérbeli jelenségek mellett

 

Kiinduló szuszpenzió	koncentráció	logN	Akusztikai jelenség	D
(g/l)	N (db/ml)			(sec)
3,2	1,792*107	7,25	Kavitáció	44,05
7,04	3,942*107	7,59	Akusztikus áramlás	140
	1,516*107	7,18	Állóhullám	433
	1,304*107	7,11	Kavitáció	99

 

 

 

 

 

 

 

 

Következtetések, javaslatok

 

Az ultrahangtérbeli jelenségek tudatos megválasztásával tehát célirányos tevékenységet folytathatunk. Azonban az ultrahang felhasználásának akár az előzőekben ismertetett egyszerű sejtfeltárási felhasználási célhoz szükséges kísérleti paraméterek nem megfelelő megválasztása a hangtérben nem kívánatos jelenségek megjelenését eredményezheti, amelyek megnehezíthetik, vagy ellehetetleníthetik az ultrahangos munkát, akár egy egyszerű kereskedelmi roncsolónál is. Az ultrahangos munka alapvető követelménye kell, hogy legyen a jelenségcentrikus nézőpont, még abban az esetben is, ha a kísérleti körülményeket nem lehet állandósítani.

 

Irodalomjegyzék

 

1.      1.    Bíró, I. (1976): Mikrobiológiai Gyakorlatok. ATE Mezőgazdaságtudományi Kar, Tejgazdaságtani és Mikrobiológiai Tanszék. P.: 64.

2.      2.    Blackshear, P. L. – Blackshear, G. L. (1987): Mechanical hemolysis. In: Skalak, R. – Chien, S. eds. Handbook of bioengineering. New Zork: McGraw-Hill, pp. 15.1-15.9.

3.      3.    Brayman, A. A. – Azadniv, M. – Miller, M. W. – Chen, X. (1994): Bubble recycling and ultrasonic cell lysis in a stationary exposure vessel. J. Acoust. Soc. Am. Vol. 96. pp. 627-633.

4.      4.    Deák, T. (1997): Élelmiszeripari Mikrobiológia. Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Tartósítóipari Kar. Pp.: 51-54.

5.      5.    Eckart, C. (1948): Phys. Rev. 73, p.68.

6.      6.    Frizzel, L. A. (1988): in Suslick, S. K. (1988): Ultrasound, Its Chemical, Phisical, and Biological Effets. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim.

7.      7.    Fry, F. J. (1978): Ultrasound: Its Applications in Medicine and Biology. Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam-Oxford-New York.

8.      8.    Horbenko, I. G. (1977): Ultrahang a gépiparban. Műszaki Könyvkiadó, Budapest. p. 186.

9.      9.    Gröschl, M. – Trampler, F. – Benes, E. – Nowotny, H. (1999): Analysis os composite resonators for ultrasonic micromanipulation and separation. Acustica – acta acustica 85, Supplement 1, p. S92, as well as in Journal of Acoustical Society of America Vol. 105, p. 1018, February 1999.

10.  10.                      Liebeskind, D. – Bases, R. – Elequin, F. – Neubrot, S. – Leifer, R. – Goldberg, R. – Koenigsberg, M. (1979): Diagnostic ultrasound: effects on the DNA and growth patterns of animals cells. Radiology. Vol. 131, pp. 177-184.

11.  11.                      Loverock, P. – ter Haar, G. (1991): Synergism between hyperthermia, ultrasound and gamma irradiation. Ultrasound in Med & Biol., Vol. 17, pp. 607-612.

12.  12.                      Lőrincz, A. – Neményi, M. (2001): Cell decrease by ultrasonic effect on yeast (Saccharomyces cerevisiae) suspension and the limit concentration of cavitation. Phisical Methods In Agriculture, Praha, Aug. 28-30.

13.  13.                      Miller, M. W. – Miller, D. L. – Brayman, A. A. (1996): A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound in Med & Biol., Vol. 22, No. 9, pp. 1131-1154.

14.  14.                      Miller, D. L. – Thomas, R. M. (1994): Cavitation dosimerty: estimates for single bubbles in rotating-tube exposure system. Ultrasound in Med & Biol., Vol. 20, pp. 197-193.

15.  15.                      Suslick, S. K. (1988): Ultrasound, Its Chemical, Phisical, and Biological Effets. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim.

16.  16.                      Tar, F. (1982): Ultrahangfizika. Kohó- és Gépipari Továbbképző és Módszertani Intézet, Budapest.

17.  17.                      Tarnóczy, T. (1963): Ultrahangok. Műszaki Könyvkiadó, Budapest. p.271.

18.  18.                      Thacker, J. (1973): An approach the mechanism of killing cells in suspension by ultrasound. Biochem. Biophis. Acta. 304, 240.

19.  19.                      Veit, I. (1977): Műszaki Akusztika. Műszaki Könyvkiadó, Budapest. p.: 169.

20.  20.                      Walsh, P. – Radel, S. -  McLoughlin, A. J. –Gherardini, L. – Benes, E. (1999): Evaluation of the effect of immobilisation techniques and low intensity ultrasonic waves on brewer’s yeast cells. Poster presentation, to be published in Proc. of the Ninth European Congress on Biotechnology, Brussels, July 11th – 15th, 1999.