[Letölthető változat]

Publikálva:

 

Neményi, M. – Lőrincz, A. (2002): Komplex ultrahangrendszer értékelése a besugárzás miatt kialakult mikroorganizmus-csíraszám csökkentő hatás alapján. MTA-AMB Kutatási-Fejlesztési Tanácskozás, Gödöllő, 2002. január 20-21. Vol. 2. pp. 145-149.

 

Komplex ultrahangrendszer értékelése a besugárzás miatt kialakult mikroorganizmus-csíraszám csökkentő hatás alapján

 

1. Bevezetés

 

         Az élelmiszereink minőségét veszélyeztető ágensek közül a mikroorganizmusok, mint ételfertőzést, illetve bizonyos körülmények között ételmérgezést előidéző szervezetek az élen járnak. Sok technológiai megoldás áll a modern élelmiszeripar rendelkezésére, hogy ezt a veszélyforrást a minimálisra csökkentse. Ezek a megoldások azonban a mai élelmiszerekkel szemben támasztott követelményeknek nem minden esetben felelnek meg. Erre példa, hogy a legáltalánosabban alkalmazott hőkezelés során egyes vitaminok inaktiválódhatnak, vagy a fehérjék denaturálódhatnak, így az adott élelmiszer biológiai értéke csökkenhet. Természetesen vannak az egyes élelmiszerekre speciálisan alkalmazott precíziós csíraszám csökkentési eljárások is, amelyek bekerülése jóval nagyobb költségráfordítást igényel a hagyományos módszerekkel szemben. Azonban az ebből származó piaci versenyhelyzet előny miatt az élelmiszeriparban reményeink szerint ez utóbbi törekvés kerül előtérbe. Az általunk vizsgált ultrahangos csírátlanítási módszer nem újdonság az élelmiszeriparban. A hetvenes évek népélelmezési törekvései természetesen a módszer alkalmatlanságát bizonyították. A mai társadalmi fogyasztói igények azonban lehetővé teszik kiváló minőségű élelmiszerek előállítását. Ezen gondolatok alapján végeztük el kísérleteinket, melyek eredményeképpen tovább bízhatunk a módszer alkalmazhatóságában.

 

2. Irodalmi áttekintés

 

Thacker1, vizsgálta a haploid és diploid pékélesztő (Saccharomyces cerevisiae) sejtek túlélését, és eltéréseket tapasztalt. Méghozzá ezzel kapcsolatban nem szinkronizált populációk vizsgálatát javasolja, a sejtek eltérő kavitációs érzékenysége miatt, ezáltal a kapott túlélési görbék nem egy, hanem több fázisúak lesznek lefutásukban. Emiatt az eredményei bizonyos eltérést mutattak a szokványos exponenciális túlélési görbétől, habár a kavitációs határon dolgozó kutatók a pusztulási arányt az egyszerűség kedvéért állandó exponenciális lefutásúra veszik. Hughes2, szintén élesztő sejteket tárt fel kavitáció segítségével és arra a megállapításra jutott, hogy a kavitáció során keletkező szabad gyökök kevésbé járulnak hozzá a sejtek feltáródásához, mint a kavitáció mechanikai roncsoló hatásai. Hradzia3, ezzel kapcsolatosan azt állítja, hogy a sejt szuszpenziókban keletkező szabadgyökök és más anyagok által kiváltott szonokémiai hatások a sejtek életképességének mindössze 2-3 %-os csökkenését okozzák. Thacker4, vizsgált továbbá négy genetikai rendszerhez tartozó élesztő sejteket, az ultrahang mutagén hatásának tekintetében. A mitokondriális DNS-ben legtöbbször mutációs hatás volt kimutatható, azon a frekvencián és intenzitáson, ahol kavitáció alakult ki. A mutagén hatás pedig növekedett a hőmérséklet emelkedésével. D.E Hughes és W.L. Nyborg5, Vizsgálták az Escherichia coli baktériumok ultrahang általi pusztulását, és azt tapasztalták, hogy stabil kavitáció esetében is megtörtént a sejtek pusztulása, így ez alapján azt állítják, hogy a tranziens, összeomló típusú kavitáció nem elengedhetetlen a sejtek széttöredezéséhez. Ter Haar6 szerint, az ultrahangnak alávetett sejtek esetében, amelyeknél hőmérséklet növekedés lép fel és amely sejtek nem pusztulnak el rögtön, ott szaporodóképesség vesztés lép fel. Chapmann7, kimutatta, hogy az ultrahang képes szubletális változásokat indukálni a plazmamembránban például a kálium anyagforgalom azonnali csökkenésével.

 

3. Anyag és módszer

 

Kísérleti teszt mikroorganizmusként 1 g pékélesztőt (Saccharomyces cerevisiae) szuszpendáltattunk 500 ml vízben, így a sejtkoncentráció 2*106/ml. A jobb detektálhatóság miatt a szuszpenzióba egy csepp metilén kék oldatot cseppentettünk ez így még nem befolyásolta a mikroorganizmus vitalitását. Ezt a szuszpenziót folyadékáramoltatásos rendszerbe töltöttük perisztaltikus pumpa segítségével. A folyadékáramoltatásos rendszert azért alkalmazunk, mert a különböző céllal alkalmazott szerkezeti egységeket lehetetlen egy térben elhelyezni. A folyadékot a betöltés és a rendszer rövidre zárása után a perisztaltikus pumpa keringeti a különböző szerkezeti egységek között. A folyadékot ezek után nem közvetlenül, hanem speciálisan erre a célra kialakított átfolyó küvetták által kezelhetjük, illetve vizsgálhatjuk. Így a szuszpenzió speciálisan kialakított ultrahangos kezelő küvettákon keresztül csatlakozik az ultrahangos rendszerhez, ahol a tulajdonképpeni kezelés történik adott frekvencián és teljesítményen. Majd a folyadék tovább haladva a detektorként alkalmazott biológiai mikroszkópban elhelyezett detektorcellába jut, ahonnan a kép CCD kamerán át a számítógépes archiváló rendszerbe, illetve egy speciális álszín-kódoló nevű műszerbe jut. A műszer a szürkeségi fokok alapján képes különbséget tenni az objektumok között, és ezt területegységre vonatkoztatja. A területegységeket két pontos kalibráció alapján is képes állandóan nyomon kísérni és jelen esetben a sejtpusztulás mértékét az előzetesen kalibrált 100%-os értékhez képest kijelezni, valamint ezt az értéket feszültségjellé alakítva egy plotterhez irányítani, ahol idő függvényében görbét kapunk, amely alapján a mindenkori sejtkoncentrációt kísérhetjük nyomon. A rendszerhez tartozik még egy termosztát, amely állandó hőmérsékletet biztosít. A rendszerek egymáshoz kapcsolódnak. Mivel az analitikai egység még fejlesztési stádiumban van, a kapott sejtszám értékek a folyadékrendszer megcsapoló csonkján időegységenként vett minta sejtszámának immerziós objektív alatti leszámolásával kerülnek meghatározásra. Sejtnek minden esetben az ép sejtfallal rendelkező vitalitást tükröző sejtek minősülnek. A kezeléseket 0,8-1MHz frekvencia mellett 7,5; 9,6; 10,5 és 12 W/cm2 teljesítményeken végeztük és meghatározott időpontokban mintát vettünk a szuszpenzióból, amit kiértékeltünk az immerziós objektív alatt látható átlagos sejtszámok alapján.

 

4. Eredmények és értékelésük

 

A mintavételek sejtszám alakulása százalékos arányban az 1. táblázatból, és az 1. ábrából látszik. Láthatjuk hogy a nagyobb teljesítmények alkalmazása mellett az idő függvényében drasztikusabb sejtpusztulások figyelhetők meg. Hogy egy modellképletet kaphassunk, a rendszert 22 db/látótér kiinduló sejtszámokra korrigáltuk (2. táblázat) és ezeket az értékeket pontdiagramban ábrázoltuk. A pontokra különböző trendfüggvényeket helyezve (2. ábra) a logaritmusos trendfüggvények mutatták a legmagasabb szintű korrelációt. A függvények addíciós és szorzó tényezőire trend függvényeket helyezve, végeredményképpen a 3. táblázatban látható képletet kaptuk. Ennek segítségével kiszámítható, hogy adott kiinduló sejtszámú anyagot mekkora teljesítményű ultrahanggal kell kezelni, hogy a sejtszám a kívánt értékre csökkenjen adott idő elteltével, vagy éppen egy állandó teljesítményű ultrahang behatás idejét lehet meghatározni a szükséges sejtszám eléréséhez. Természetesen ezek az értékek a mi rendszerünkre vonatkoznak, és általános alkalmazhatóságához korrekciós tényezőt kell alkalmazni az aktuális viszonyoknak megfelelően. Végül az 3. ábrán a 7,5 W/cm2 teljesítményű kezelés visszahelyettesítését mutatja, azt hogy a képlet a valóságos kiinduló sejtszámhoz képest soha nem mutat 15%-nál nagyobb eltérést.

 

1, táblázat: Látóterenkénti sejtszám alakulása az idő függvényében a kiindulási sejtszámot   100%-ban meg határozva

 

 

Immerziós

látóterenkénti

sejtszám

(%)

kezelési idő (perc)

7,5W/cm2

9,6W/cm2

10,5W/cm2

12W/cm2

0

100

100

100

100

15

65,21

63,63

66,66

56

30

56,552

50

40

44

60

52,17

40,9

20

16

105

39,13

22,72

10

8

165

32,6

13,63

6,66

4

250

21,73

3,63

2

0,8

265

19,56

2,27

0

 

285

17,39

0,9

 

 

405

1,7

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


1.  ábra: Élesztő sejtszám változása az idő függvényében a különböző teljesítményű ultrahang kezelések hatására

 

 2, táblázat: 22 db/ látótér sejtszámra korrigált kiindulási sejtszám

 

Az immerziós látótérben számlált sejtek számának 22 darabra történő korrekciója a logaritmusos trendfüggvény érdekében

 

7,5

9,6

10,5

12,0

4,0

40,0

1

22,0

22,0

22,0

22,0

24,4

20,9

15

14,3

14,0

14,7

12,3

18,5

2,9

30

12,4

11,0

8,8

9,7

16,9

-1,8

60

11,5

9,0

4,4

3,5

15,4

-6,4

105

8,6

5,0

2,2

1,8

14,2

-10,1

165

7,2

3,0

1,5

0,9

13,2

-13,1

250

4,8

0,8

0,4

0,2

12,2

-15,9

265

4,3

0,5

 

 

12,1

-16,3

285

3,8

0,2

 

 

12,0

-16,8

405

0,4

 

 

 

11,2

-19,1


2. ábra: 22 db/ látótér sejtszámra korrigált kiindulási sejtszám pontdiagrammja, illetve az alap trendfüggvények

 

3. táblázat: a végső összefüggés az ultrahangos kezelés modellezésére

 

y=a*lnx0+b (x0=idő, min)

a=-1.9376*lnx1+0.4753 (x1=teljesítmény, W/cm2)

b=-1.5277*lnx1+26.567 (X1=teljesítmény, W/cm2)

 

 


 

 

 3. ábra: a valós és a képlet alapján számított értékek egymásra vetítése

 

5. Következtetés 

 

         Az ultrahangos kezelés nagy reményeket nyújt a precíziós fizikai élelmiszerkezelések csoportjában. A jövőben a mikrobiális szelektivitás vizsgálata, a koncentráció és hőmérséklet függés tanulmányozása a célunk.

 

6. Irodalomjegyzék

 

1.    1.    Thacker, J. (1973): An approach the mechanism of killing cells in suspension by ultrasound. Biochem. Biophis. Acta. 304, 240.

2.    2.    Hughes, D. E. (1961): J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng., 3. p. 405.

3.    3.    Hrazdira, I. – Skorpikova, J. – Dolnikova, M. –Janicsh, R. – Mornstein, V. (1998): The combined effect of ultrasound and cytostatic treatment on the cytoskeleton of HeLa cells. Folia Biol, 44 (Suppl.): S 14.

4.    4.    Thacker, J. (1974): Brit. J. Radiol. 47, p.130.

5.    5.    Hughes, D. E. and Nyborg, W. L. (1962): Cell disruption by ultrasound. Science, 38:108-114s

6.    6.    ter Haar, G. R. – Straford, I. J. – Hill, C. R. (1980): Br. J. Radiol. 53, 784.

7.    7.    Chapman, I. V. (1974): Br. J. Radiol. 47, 411.