[Letölthető változat]
Publikálva: Neményi, M. – Lőrincz, A. (2002): Komplex
ultrahangrendszer értékelése a besugárzás miatt kialakult
mikroorganizmus-csíraszám csökkentő hatás alapján. MTA-AMB Kutatási-Fejlesztési
Tanácskozás, Gödöllő, 2002.
január 20-21. Vol. 2. pp. 145-149. Komplex ultrahangrendszer
értékelése a besugárzás miatt kialakult mikroorganizmus-csíraszám csökkentő
hatás alapján 1. Bevezetés Az
élelmiszereink minőségét veszélyeztető ágensek közül a mikroorganizmusok, mint
ételfertőzést, illetve bizonyos körülmények között ételmérgezést előidéző
szervezetek az élen járnak. Sok technológiai megoldás áll a modern
élelmiszeripar rendelkezésére, hogy ezt a veszélyforrást a minimálisra
csökkentse. Ezek a megoldások azonban a mai élelmiszerekkel szemben támasztott
követelményeknek nem minden esetben felelnek meg. Erre példa, hogy a
legáltalánosabban alkalmazott hőkezelés során egyes vitaminok inaktiválódhatnak, vagy a fehérjék denaturálódhatnak, így
az adott élelmiszer biológiai értéke csökkenhet. Természetesen vannak az egyes
élelmiszerekre speciálisan alkalmazott precíziós csíraszám csökkentési
eljárások is, amelyek bekerülése jóval nagyobb költségráfordítást igényel a
hagyományos módszerekkel szemben. Azonban az ebből származó piaci
versenyhelyzet előny miatt az élelmiszeriparban reményeink szerint ez utóbbi
törekvés kerül előtérbe. Az általunk vizsgált ultrahangos csírátlanítási
módszer nem újdonság az élelmiszeriparban. A hetvenes évek népélelmezési
törekvései természetesen a módszer alkalmatlanságát bizonyították. A mai
társadalmi fogyasztói igények azonban lehetővé teszik kiváló minőségű
élelmiszerek előállítását. Ezen gondolatok alapján
végeztük el kísérleteinket, melyek eredményeképpen tovább bízhatunk a módszer
alkalmazhatóságában. 2. Irodalmi
áttekintés Thacker1, vizsgálta a haploid és diploid pékélesztő (Saccharomyces cerevisiae)
sejtek túlélését, és eltéréseket tapasztalt. Méghozzá ezzel kapcsolatban nem
szinkronizált populációk vizsgálatát javasolja, a sejtek eltérő kavitációs érzékenysége miatt, ezáltal a kapott túlélési
görbék nem egy, hanem több fázisúak lesznek lefutásukban. Emiatt az eredményei
bizonyos eltérést mutattak a szokványos exponenciális túlélési görbétől, habár
a kavitációs határon dolgozó kutatók a pusztulási
arányt az egyszerűség kedvéért állandó exponenciális lefutásúra veszik. Hughes2,
szintén élesztő sejteket tárt fel kavitáció
segítségével és arra a megállapításra jutott, hogy a kavitáció
során keletkező szabad gyökök kevésbé járulnak hozzá a sejtek feltáródásához,
mint a kavitáció mechanikai roncsoló hatásai. Hradzia3,
ezzel kapcsolatosan azt állítja, hogy a sejt szuszpenziókban keletkező
szabadgyökök és más anyagok által kiváltott szonokémiai
hatások a sejtek életképességének mindössze 2-3 %-os
csökkenését okozzák. Thacker4, vizsgált továbbá négy
genetikai rendszerhez tartozó élesztő sejteket, az ultrahang mutagén hatásának tekintetében. A mitokondriális
DNS-ben legtöbbször mutációs hatás volt kimutatható, azon a frekvencián és
intenzitáson, ahol kavitáció alakult ki. A mutagén hatás pedig növekedett a
hőmérséklet emelkedésével. D.E Hughes
és W.L. Nyborg5, Vizsgálták az Escherichia
coli baktériumok ultrahang általi pusztulását, és azt tapasztalták, hogy
stabil kavitáció esetében is megtörtént a sejtek
pusztulása, így ez alapján azt állítják, hogy a tranziens, összeomló típusú kavitáció nem elengedhetetlen a sejtek széttöredezéséhez.
Ter Haar6 szerint, az ultrahangnak
alávetett sejtek esetében, amelyeknél hőmérséklet növekedés lép fel és amely sejtek nem pusztulnak el rögtön, ott szaporodóképesség
vesztés lép fel. Chapmann7, kimutatta, hogy az ultrahang
képes szubletális változásokat indukálni a
plazmamembránban például a kálium anyagforgalom azonnali csökkenésével. 3. Anyag és módszer Kísérleti teszt
mikroorganizmusként 1 g pékélesztőt (Saccharomyces
cerevisiae) szuszpendáltattunk 500 ml vízben, így
a sejtkoncentráció 2*106/ml. A jobb detektálhatóság miatt a
szuszpenzióba egy csepp metilén kék oldatot cseppentettünk ez így még nem
befolyásolta a mikroorganizmus vitalitását. Ezt a szuszpenziót folyadékáramoltatásos rendszerbe töltöttük perisztaltikus
pumpa segítségével. A folyadékáramoltatásos rendszert
azért alkalmazunk, mert a különböző céllal alkalmazott szerkezeti egységeket
lehetetlen egy térben elhelyezni. A folyadékot a betöltés és a rendszer rövidre
zárása után a perisztaltikus pumpa keringeti a különböző szerkezeti egységek
között. A folyadékot ezek után nem közvetlenül, hanem speciálisan erre a célra
kialakított átfolyó küvetták által kezelhetjük,
illetve vizsgálhatjuk. Így a szuszpenzió speciálisan kialakított ultrahangos
kezelő küvettákon keresztül csatlakozik az
ultrahangos rendszerhez, ahol a tulajdonképpeni kezelés történik adott
frekvencián és teljesítményen. Majd a folyadék tovább haladva a detektorként
alkalmazott biológiai mikroszkópban elhelyezett detektorcellába jut, ahonnan a
kép CCD kamerán át a számítógépes archiváló rendszerbe, illetve egy speciális
álszín-kódoló nevű műszerbe jut. A műszer a szürkeségi fokok alapján képes
különbséget tenni az objektumok között, és ezt területegységre vonatkoztatja. A
területegységeket két pontos kalibráció alapján is képes állandóan nyomon
kísérni és jelen esetben a sejtpusztulás mértékét az előzetesen kalibrált
100%-os értékhez képest kijelezni, valamint ezt az értéket feszültségjellé
alakítva egy plotterhez irányítani, ahol idő függvényében görbét kapunk, amely
alapján a mindenkori sejtkoncentrációt kísérhetjük nyomon. A rendszerhez
tartozik még egy termosztát, amely állandó hőmérsékletet biztosít. A rendszerek
egymáshoz kapcsolódnak. Mivel az analitikai egység még fejlesztési stádiumban
van, a kapott sejtszám értékek a folyadékrendszer megcsapoló csonkján
időegységenként vett minta sejtszámának immerziós objektív alatti
leszámolásával kerülnek meghatározásra. Sejtnek minden esetben az ép sejtfallal
rendelkező vitalitást tükröző sejtek minősülnek. A kezeléseket 0,8-1MHz frekvencia mellett 7,5; 9,6; 10,5 és 12
W/cm2 teljesítményeken végeztük és meghatározott időpontokban mintát
vettünk a szuszpenzióból, amit kiértékeltünk az immerziós objektív alatt
látható átlagos sejtszámok alapján. 4. Eredmények és értékelésük A mintavételek sejtszám
alakulása százalékos arányban az 1. táblázatból, és az 1. ábrából látszik.
Láthatjuk hogy a nagyobb teljesítmények alkalmazása mellett az idő függvényében
drasztikusabb sejtpusztulások figyelhetők meg. Hogy egy modellképletet
kaphassunk, a rendszert 22 db/látótér kiinduló sejtszámokra korrigáltuk (2.
táblázat) és ezeket az értékeket pontdiagramban ábrázoltuk. A pontokra
különböző trendfüggvényeket helyezve (2. ábra) a logaritmusos trendfüggvények
mutatták a legmagasabb szintű korrelációt. A függvények addíciós és szorzó
tényezőire trend függvényeket helyezve, végeredményképpen a 3. táblázatban
látható képletet kaptuk. Ennek segítségével kiszámítható, hogy adott kiinduló
sejtszámú anyagot mekkora teljesítményű
ultrahanggal kell kezelni, hogy a sejtszám a kívánt értékre csökkenjen adott
idő elteltével, vagy éppen egy állandó teljesítményű ultrahang behatás idejét lehet meghatározni a szükséges
sejtszám eléréséhez. Természetesen ezek az értékek a mi rendszerünkre
vonatkoznak, és általános alkalmazhatóságához korrekciós tényezőt kell
alkalmazni az aktuális viszonyoknak megfelelően. Végül az
3. ábrán a 7,5 W/cm2 teljesítményű kezelés visszahelyettesítését
mutatja, azt hogy a képlet a valóságos kiinduló sejtszámhoz képest soha nem
mutat 15%-nál nagyobb eltérést. 1,
táblázat: Látóterenkénti sejtszám alakulása az idő függvényében a kiindulási sejtszámot 100%-ban
meg határozva
2, táblázat: 22 db/ látótér sejtszámra
korrigált kiindulási sejtszám
2. ábra: 22 db/ látótér
sejtszámra korrigált kiindulási sejtszám pontdiagrammja,
illetve az alap trendfüggvények 3.
táblázat: a végső összefüggés az ultrahangos kezelés modellezésére
3. ábra: a valós és a
képlet alapján számított értékek egymásra vetítése 5. Következtetés
Az
ultrahangos kezelés nagy reményeket nyújt a precíziós fizikai
élelmiszerkezelések csoportjában. A jövőben a mikrobiális
szelektivitás vizsgálata, a koncentráció és hőmérséklet függés tanulmányozása a
célunk. 6.
Irodalomjegyzék 1. 1. Thacker, J. (1973): An approach the
mechanism of killing cells in
suspension by ultrasound. Biochem. Biophis. Acta. 304, 240. 2. 2. Hughes, D. E. (1961): J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng.,
3. p. 405. 3. 3. Hrazdira, I. – Skorpikova,
J. – Dolnikova, M. –Janicsh,
R. – Mornstein, V. (1998): The combined
effect of ultrasound and cytostatic treatment on the cytoskeleton
of HeLa cells.
Folia Biol, 44 (Suppl.): S 14. 4. 4. Thacker, J. (1974): Brit. J. Radiol. 47, p.130. 5. 5. Hughes, D. E. and
Nyborg, W. L. (1962): Cell disruption by ultrasound.
Science, 38:108-114s 6. 6. ter Haar,
G. R. – Straford, I. J. – Hill,
C. R. (1980): Br. J. Radiol.
53, 784. 7. 7. Chapman, I. V. (1974): Br. J. Radiol. 47, 411. |