|
[Bevezetés]
[Irodalmi áttekintés]
[Anyag és módszer]
[Eredmények és értékelésük]
[Következtetések, javaslatok]
[Összefoglalás]
[Irodalomjegyzék]
[Melléklet]
[Tézisek]
[Theses]
DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
LŐRINCZ ATTILA
NYUGAT-MAGYARORSZÁGI EGYETEM MEZŐGAZDASÁG- ÉS ÉLELMISZERTUDOMÁNYI KAR MOSONMAGYARÓVÁR
2004
NYUGAT-MAGYARORSZÁGI EGYETEM MEZŐGAZDASÁG- ÉS ÉLELMISZERTUDOMÁNYI KAR MOSONMAGYARÓVÁR Agrárműszaki, Élelmiszeripari és Környezettechnikai Intézet
Program- és Doktori Iskola Vezető Prof. Dr Schmidt János, DSc az MTA levelező tagja
Alprogram- és témavezető Prof. Dr. Neményi Miklós, DSc az MTA doktora
ÉLELMEZÉSI CÉLÚ BIOLÓGIAI ANYAGOK ULTRAHANGOS BESUGÁRZÁSÁNAK ÉLELMISZERFIZIKAI ÉS MIKROBIOLÓGIAI VONATKOZÁSAI
Készítette: LŐRINCZ ATTILA
MOSONMAGYARÓVÁR 2004
ÉLELMEZÉSI CÉLÚ BIOLÓGIAI ANYAGOK ULTRAHANGOS BESUGÁRZÁSÁNAK ÉLELMISZERFIZIKAI ÉS MIKROBIOLÓGIAI VONATKOZÁSAI
Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében A Nyugat-Magyarországi Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar
Állati termék előállítás biológiai, technológiai, ökológiai, takarmányozási és ökonómiai kérdései programja
Biológiai anyagok energiatakarékos és minőségmegőrző szárítása, tárolása és feldolgozása
Írta:
LŐRINCZ ATTILA
A jelölt a doktori szigorlaton…………%-ot ért el,
Mosonmagyaróvár, ………………………………
.………………………………. a Szigorlati Bizottság Elnöke
Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom (igen/nem)
Első bíráló (Dr. ………………………………) igen/nem
(aláírás) Második bíráló (Dr. ………………………………) igen/nem
(aláírás) Esetleg harmadik bíráló (Dr. ………………………………) igen/nem
(aláírás)
A jelölt az értekezés nyilvános vitáján ……………%-ot ért el.
Mosonmagyaróvár, ……………………………… A Bírálóbizottság elnökeDoktori (PhD) oklevél minősítése…………………
Az EDT elnöke
TARTALOMJEGYZÉK1. BEVEZETÉS
2. Irodalmi
áttekintés 2.2. Az ultrahang általános élelmiszerfizikai és biológiai hatásai
2.3. Alkalmazott ultrahang fizikai és biológiai 2.4. Sugárzási erőtér kutatásának szakirodalmi háttere 2.5. Az akusztikai kavitáció szakirodalmi áttekintése 2.5.1. A kavitáció megjelenési formái 2.5.2. A kavitációs küszöb 2.5.3. A kavitáció detektálása
2.5.4. A
kavitációs mag elméletek és a kavitációs küszöb 2.6. Az ultrahang sejtbiológiai hatásai
2.6.1. Az
ultrahang sejtbiológiai hatásainak 2.7. Az állóhullám és biológiai hatásai 2.8. Akusztikai áramlás 2.8.1. Akusztikai energia hangtérbeli elváltozásai2.8.2. Akusztikai energia elváltozásának vizsgálata biológiai anyagokban 2.9. Az aktív ultrahang biológiai felhasználási lehetőségei 2.10. Alkalmazott mikrobiológia 2.11. Munkánk célja a szakirodalmak ismeretében
3. Anyag és módszer
3.1.
Folyadékáramoltatásos ultrahangrendszer 3.1.2. A kezelés definíciója 3.1.3. A célobjektumhoz jutó ultrahang intenzitás meghatározása
3.2. Nem
állandó hőmérsékletű ultrahang sugárzófejjel 3.3. Hőhatás meghatározásának eszközei ultrahangtérben 3.3.1. Az ultrahang hőhatásának vizsgálati módszere 3.4. Akusztikai jelenségek kialakulásának vizsgálata 3.4.1. Kezelő berendezések 3.4.2. Vizsgált szuszpenzió 3.4.3. Kavitációs zaj vizsgálata 3.4.4. Kavitációs határkoncentráció meghatározása
3.4.4.1.
Kavitációs határkoncentráció meghatározásának
3.4.4.2.
Kiegészítő módszer kavitációs 3.4.5. Kavitáció kialakulási időintervallum vizsgálata 3.4.6. Kísérleti terv
3.5. Pusztulási
dinamika meghatározása az akusztikai 3.5.1. Kezelő berendezések 3.5.2. Szuszpenzió 3.5.3. Az akusztikai jelenségek és a sejtbiológiai hatások vizsgálata 3.5.4. Kísérleti terv 3.5.5. Vitális sejtszám és a hangtér akusztikai jelenségeinek szimultán vizsgálata 3.6. Sejtanalitikai eljárások 3.6.1. Analóg sejtanalízis 3.6.2. Digitális sejtanalízis 3.7. Pseudomonas aeruginosa HNCMB170001 feltételesen kórokozó baktériumtörzs ultrahangkezekésének anyaga és módszere 3.7.1. A referenciatörzs felélesztése 3.7.2. Sejtkoncentráció beállítása 3.7.3. Pseudomonas aeruginosa HNCMB170001baktériumtörzs élősejtszám meghatározása összcsíraszám meghatározással 3.7.4. Kontrollvizsgálat 3.7.5. Minták kezelése 3.8. Az ultrahang szelektív sejtbiológiai hatása
4. Eredmények és értékelésük 4.1. Folyadékáramoltatásos kísérletsorozat eredményei 4.1.1. Sejtroncsoló hatás 4.1.2. Intenzitásváltozás folyadékáramoltatásos rendszerben
4.1.3.
Mikrobiológiai elemzés pusztulási dinamikára 4.3. Ultrahang hőhatásvizsgálatának eredményei 4.3.1. A mérőeszközök összehasonlítása 4.3.2. Hőmérsékletváltozási vizsgálatok eredményei 4.3.3. A kavitáció dinamikájának hatása a hőképződésre 4.4. Az akusztikai jelenségek vizsgálati eredményei 4.4.1. Kavitációs zaj vizsgálatának eredményei 4.4.2. Akusztikai jelenségek hangtérbeli kialakulásának vizsgálati eredményei 4.5. A Saccharomyces cerevisiae élesztőgomba túlélési dinamikájának eredményei, az akusztikai jelenségek figyelembevételével 4.5.1. A túlélési dinamikai alapvizsgálatainak eredményei 4.5.2. Az ultrahangtér akusztikai jelenségei 4.5.3. Túlélési dinamika vizsgálat eredményei 4.6. A sejtanalitikai módszerek alkalmazásának eredményei 4.6.1. Analóg módszer eredményei 4.6.2. Digitális sejtanalitikai módszer alkalmazásának eredményei 4.7. Pseudomonas aeruginosa HNCMB170001 baktériumtörzs ultrahangkezelésének sejtbiológiai hatásai 4.8. Biológiai ultrahang kísérletek eredményeinek összesítése 4.8.1. Az ultrahang hatásának összesítése Saccharomyces cerevisiae élesztőgombára
4.8.2. Az
ultrahang hatásának összesítése 4.8.3. Szelektivitási kritériumok
5. Következtetések, Javaslatok 5.1. Folyadékáramoltatásos és a nem állandó hőmérsékletű ultrahangvizsgálatok 5.2. Ultrahang hőhatása 5.3. Az akusztikai jelenségek vizsgálata 5.4. Saccharomyces cerevisiae baktérium élesztőgomba túlélési dinamikájának értékelése az akusztikai jelenségek figyelembevételével 5.5. Sejtanalitikai módszerek 5.6. Pseudomonas aeruginosa ultrahangkezelése 5.7. Szelektív ultrahanghatás kritériumai
6. ÖSSZEFOGLALÁS 7. SUMMARY8. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK9. KIVONAT10. KÖSZÖNETNYILVÁNíTÁS
11. Irodalomjegyzék I. MELLÉKLETII. MELLÉKLETIII. A. MELLÉKLETIII. B. MELLÉKLETIV. MELLÉKLETV. MELLÉKLETVI. MELLÉKLETVII. MELLÉKLET
1. BEVEZETÉS
A munkánk célja az volt, hogy a nagyfrekvenciás és nagyenergiájú aktív ultrahang sejtkárosító hatását különböző típusú ultrahangrendszerekben megvizsgáljuk illetve, hogy tisztázzuk az ultrahang biológiai hatásainak okait, valamint a sejtroncsoló hatásokat célszerűen befolyásoljuk, bizonyos fizikai paraméterek megváltoztatásával. A dolgozat folyamatában követi a munkákat úgy, hogy az egyes fázisokban leszűrt következtetésekből hogyan és merre léptünk tovább. Ez alapján összesen nyolc egymásra épülő kísérletsorozatból, vagy lépcsőből áll a dolgozat és az egyes lépcsők, konvencionális dolgozati felépítésben találhatóak. Az első kísérletsorozatban 20ºC állandó hőmérsékleten tartott, folyadékáramoltatásos ultrahangkezelő rendszert építettünk, amellyel az volt a célunk, hogy különböző, 7,5 – 12W/cm2 kibocsátott ultrahang teljesítmények mellett, megvizsgáljuk, hogy 1110kHz ultrahang frekvencián milyen összefüggés áll fenn a marker Saccharomyces cerevisiae pékélesztőgomba túlélési dinamikája, tizedelődési időintervallum értékei és az alkalmazott kibocsátott ultrahang teljesítmények között. Meghatároztuk a túlélési, rezisztencia, majd a pusztulási görbéket. Kiszámítottuk, hogy az alkalmazott kísérleti felépítményben, mennyiben módosul az ultrahang fő fizikai paramétere, a teljesítménye, amíg eléri a célobjektumot, vagyis a szuszpendált sejteket. A konvencionális mikrobiológiai képleteket átalakítva meghatároztuk a „z” értéket, a tizedelődési időintervallum tizedére csökkenéséhez szükséges ultrahang teljesítménynövekményt. A második munkafázisban, nem állandó hőmérsékleten tartott sugárzófej alkalmazásával az volt a célunk, hogy különböző kiinduló sejtkoncentrációk és teljesítmények mellett megvizsgáljuk, milyen összefüggés áll fenn e vizsgált tényezők között a Saccharomyces cerevisiae sejtek túlélési dinamikájának vonatkozásában. A harmadik kísérletsorozattal az volt a cél, hogy különböző hőmérsékleti, koncentráció, illetve anyagminőségi viszonyok mellett megvizsgáljuk, hogy az alkalmazott 9W/cm2 teljesítményű 1117kHz frekvenciájú ultrahang hőhatása mennyiben játszhat szerepet a biológiai hatásokban. További célunk volt, hogy a keltett hőhatás, az egyes anyagok különböző koncentrációi esetén különböző állandó hőmérsékletek mellett mennyire utal magára az adott anyagra, tehát a módszer alkalmazható-e esetleg kvantitatív és kvalitatív részecskeanalízisre, vagy az ultrahang akusztikai jelenségeinek dinamikájának elemzésére. A kísérletek végrehajtásához speciális ultrahang berendezés rendszert terveztünk és kiviteleztünk több szakmai szervezet segítségével, az első két kísérletsorozat tapasztalatai alapján, mellyel reprodukálható módon vizsgálhatók a nagyfrekvenciás aktív ultrahang fizikai és biológiai hatásai. A negyedik lépcsőben, a hőhatásnál megfigyelt akusztikai jelenség anomáliák miatt, választ kerestünk arra, hogy a szuszpenziók kvalitatív és kvantitatív tulajdonságai hogyan befolyásolják az ultrahangtérben kialakuló akusztikai jelenségek, az állóhullám, az akusztikai áramlás és esetünkben leginkább a kavitáció bekövetkezését és küszöbértékét. A vizsgálatok alatt műszeres kavitáció detektor rendszert alkalmaztunk. A vizsgálatokhoz kereskedelmi forgalomban kapható préselt, illetve szárított Saccharomyces cerevisiae pékélesztőt, valamint azzal megegyező átmérőjű dolomitkő szemcsékből álló szuszpenziót használtunk. A kísérleteket 1,117MHz frekvenciáján, 0-12W/cm2 teljesítményen végeztük, longitudinális hullámokkal. Vizsgáltuk különböző ultrahang teljesítmények mellett, a kavitáció megszüntetéséhez szükséges hangtérbeli szemcsekoncentráció g/l mennyiségét, vagyis a „kavitációs határkoncentrációt”, valamint e mennyiségek 1,5-szeresének felhasználásával a kísérletek beindításától a kavitáció ismételt kialakulásáig eltelt időintervallumot, a „kavitáció kialakulási időintervallumot”. A két érték reményeink szerint jellemezheti, előre jelezheti a hangtérben kialakuló hullámjelenségeket, a hullámjelenségek pedig az ultrahang hatásait. Az ötödik kísérletsorozatnál, a negyedik kísérletsorozatban, 9W/cm2 teljesítményen és 1117kHz frekvencián mért, hangtérbeli kavitáció megszüntetéséhez szükséges liofilizált Saccharomyces cerevisiae pékélesztő koncentráció g/l mennyiségét használtuk alapul. Ezután e mennyiség többszöröseinek felhasználásával követtük nyomon a hangtérben kialakult akusztikai jelenségeket, illetve szimultán, vitális festés segítségével a sejtek túlélési dinamikájának alakulását. A vizsgált akusztikai jelenségek az akusztikai áramlás, az állóhullám, a kavitáció voltak. A hangtér fizikai paraméterei alapvetően befolyásolták a hangtérben kialakuló akusztikai jelenségeket és azok kialakulási küszöbértékeit. A jelenségek visszahatottak a hangtér anyagi minőségére, így jelenség-hatás láncreakció zajlott le a besugárzás alatt. A hatodik lépcsőben sejtanalitikai rendszereket dolgoztunk ki az ötödik kísérletsorozat gyorsabb, egyszerűbb sorozatos kivitelezésére. A sejtanalitikai eljárás kidolgozásának célja, kísérleti alkalmazásának lényege az, hogy a fáradságos, kísérletsorozatonként több ezer túlélő sejtszám vizsgálatot, tehát a manuális munkát valamilyen módon automatizáljuk, és ezzel nagyszámú, gyors és egyszerű vizsgálatra nyíljon mód. További célunk, az eredmények archiválásának és kiértékelésének megoldása biztonságos és közérthető módon. A sejtek túlélését, analóg és digitális módon értékeltük. A hetedik kísérletsorozatban az ötödik, Saccharomyces cerevisiae élesztőgombára vonatkozó kísérletsorozat fizikai paramétereivel és két esetben 6W/cm2 teljesítményű kísérletsorozattal kiegészítve, vizsgáltuk a Pseudomonas aeruginosa HNCMB170001 baktériumtörzs túlélési dinamikáját. A nyolcadik lépcsőben az első, második és az ötödik, Saccharomyces cerevisiae élesztőgombára, illetve a hetedik kísérletsorozat Pseudomonas aeruginosa baktériumra vonatkozó eredményeit összevetettük, a megegyező fizikai paramétereik alapján. Meghatároztuk az élesztőgomba „z” értékét a teljesítményváltozás és kiinduló csíraszám változás függvényében minden kísérletre. Végül a két különböző fajhoz tartozó mikroorganizmusra vonatkozóan a kiinduló csíraszám, illetve az ultrahang teljesítmény függvényében megfogalmaztuk az egy fajon belüli és a fajok közötti szelektív ultrahanghatás kritériumait. |