Felhasznált anyagok és módszerek
A felhasznált anyagok és eszközök három
csoportra bonthatóak A, az alkalmazott kezelő berendezések, B, vizsgált szuszpenzió
és C, a detektálási rendszerek, melyeket az 1. ábra mutat sematikusan.
1.
ábra:
A felhasznált anyagok és eszközök: A.1., A.2. ultrahang frekvencia generátor és
erősítő, A.3. ultrahang rezonátor, A.4. termosztát, A.5. analitikai mérleg, B.
kísérleti szuszpenzió, C.1. audio detektor egység, C.3. biológiai detektor
egység.
Az 1. ábrán látható műszerek és berendezések részei
az „A.1.” ultrahang frekvencia előállító készülék, melynek jelgeneráló
egysége szinusz jelformát állít elő, 1 [kHz] – 16 [MHz] frekvencia
tartományban, mely 1 [kHz] frekvencia tartományonként történő manuális frekvenciaállítási
lehetőséget biztosít. A készülék az aktuálisan alkalmazott frekvencia értéket
egy monitor egységen jelzi ki. Az „A.2.” ultrahang erősítő, főleg a
megahertzes frekvencia tartományokra tervezett, de 100 [kHz] – 2 [MHz]
frekvencia tartományban viszonylag jó közelítéssel lineáris, azonos mértékű
erősítési szintet ad. Az 50 [Ω] impedancia érték mellett 0-40 [W]
erősítést tesz lehetővé, valamint az erősítés mértékét egyenfeszültségben adja
meg, melyet kalibrációs görbe segítségével és a sugárzási felület ismeretében
[W/cm2] értékre tudunk vonatkoztatni. Az „A.3.” jelű
rezonátor felépítését a 2. ábra mutatja be. A vizsgálatainkban folyamatos
hullám (CW) módot alkalmaztunk, a célszerűen tervezett rezonátorunkból adódóan
legfőbbképpen longitudinális hullámformát előállítva. A rezonátor kialakítása
kiválóan alkalmas az álló és a haladó sík hullámok kialakítására, így a
szuszpenzióban található részecskék célirányos manipulációjára, illetve
inaktiválására is.
2. ábra: A rezonátor fő
szerkezeti egységei: 1. piezoelektromos kerámia, 2. elektro-akusztikus
csatolás, 3. hangtér, 4. termosztáló edény, 5. elektromos csatolás, 6. készülék
ház, 7. elektromos csatlakozó.
A tömeg mérésére az 1. ábrán „A.4.” jelzésű
Precisa 505M-2020C DR SCS, 0,001 [g] pontosságú analitikai mérleget
alkalmaztuk. A besugárzott szuszpendáló anyagként „B” 0,5-1 órán át,
pihentetett, 20 [ºC] hőmérsékletű csapvizet alkalmaztunk, szuszpendált
anyagként liofilizált Saccharomyces cerevisiae élesztőt használtunk. Az
alkalmazott detektálási rendszerek „C” több módszer eszközeit foglalják
magukban, ezzel kapcsolatban megkülönböztethetjük a „C.1.” audio, „C.2.”
vizuális és a „C.3.” biológiai detektálási módszerek eszközeit és
berendezéseit. Az audionális módszer eszközeinek „C.1.” alkalmazásával cél
főleg a tranziens kavitáció jellegzetes sziszegő, pattogó hangjának detektálása
audionális módszerekkel, melynek fő részei a mikrofon és oszcilloszkóp. A „C.2.”
vizuális módszer azt jelenti, hogy a szemmel követhető hullámjelenségeket,
a kezelési idő függvényében folyamatosan nyomon kísérjük, ami például az álló
hullám, vagy a gomolygó áramlás, vagy a folyadék sugár kialakulása lehet, a
tapasztalt jelenségeket az idő függvényében pedig dokumentáljuk. A „C.3.”
biológiai módszer a vitális festés metilénkék festékkel. Célunk a módszer
felhasználásával az ultrahang hatására a mikroorganizmusok életképességében
beállt változások megfigyelése az alkalmazott kezelési idő függvényében. Az
adatrögzítést a biológiai mikroszkópból egy CCD kamerán keresztül beérkezett
kép számítógépes file formátumba történő rögzítése biztosítja.
A
kezeléseket 1,117 [MHz] frekvencián 9 [W/cm2] ultrahang teljesítmény
mellett végeztük 20 [˚C] hangtér hőmérséklet mellett 20 [ml]
sejtszuszpenzió jelenlétében, 3,2 illetve 7,04 [g/l] sejtkoncentráció + 3 csepp
1 % koncentrációjú metilénkék oldat mellett. A kezelési idő során 15
másodpercenként 0,02 ml szuszpenzió mintát vettünk ki automata pipettával
steril pipetta heggyel egy-egy mikroszkóp tárgylemezre, amelyekből később, egy
időponthoz tartozó több látótér leszámolásának átlagaként kaptuk meg az egy
időponthoz tartozó relatív sejtszám értékeket, amit azután táblázatos, illetve
grafikonos formában kiértékeltünk. Ezután vettük fel a különböző szuszpenzió
koncentrációkhoz tartozó túlélési görbéket. A kísérletek folyamán, a hangtérben
műszeresen és érzékszervileg tapasztalt hullámjelenségeket szintén az idő
függvényében dokumentáltuk, majd végül az eredményeket összevetettük.
Eredmények és értékelésük
A 3. ábrán a jellemző
kiindulási állapot látszik, ahol megfigyelhető, hogy a sejtek legnagyobb
hányada vitalitást tükröz, nem színeződött és az élesztőre jellemző
morfológiájú. A 4. ábrán a kezelés alatti állapot látható, ahol már a sejtek
egy része a kezelés hatására elpusztult, lyukas, festődött, a citoplazma és a
sejtszervek nagy része az extracelluláris térbe áramlottak. Az 5. ábrán pedig a
kezelés végső stádiuma figyelhető meg, ahol az alkalmazott módszer alapján
kimondható, hogy az összes sejt elpusztult.
Forrás: Lőrincz Attila, 2001’
2.
ábra:
kezelés előtti kiinduló állapot
Forrás: Lőrincz Attila, 2001’
3.
ábra:
kezelés alatti állapot
Forrás: Lőrincz Attila, 2001’
4.
ábra:
a sejtek inaktiválódása után, a kezelés végső stádiuma,
A két különböző
sejtkoncentráció (3,2 illetve 7,04 [g/l]) mellett tapasztalt túlélési dinamika
a 6. ábrán figyelhető meg (1. táblázat). Jól látszik a két különböző
koncentrációhoz tartozó túlélési görbe közti különbség. Az alacsonyabb
sejtkoncentrációhoz tartozó görbe exponenciális túlélési dinamikát mutat. A
második, magasabb sejtkoncentrációjú szuszpenzió esetében azonban három
szakaszt különíthetünk el a túlélési görbében. Az első szakasz (I) a relatív
sejtszám gyors csökkenését mutatja, ahol a haladó hullám dominál, erős
sugárnyomás érvényesül a hangtérben a szemcsék magas szintű adszorpciója miatt,
kavitáció nélkül. Ebben a szakaszban is csökken a sejtek vitalitása, ezt a
szakirodalom is megállapítja. A második szakaszban (II) a sejtszám
csökkenésének megtorpanása jellemző, ami az állóhullám felépülésének
köszönhető. A szuszpendált szemcsék jól megfigyelhetően az állóhullám nyomási
csomósíkjaiban stabilizálódnak. A harmadik szakaszban (III), az állóhullám
hatására létrejött szemcse aggregáció miatti szedimentáció hatására részlegesen
letisztult hangtérben az ultrahang adszorpció csökkenésének hatására megnövekvő
akusztikus nyomás amplitúdó miatt megindul a kavitáció, melynek zaját
detektáltuk. Ebben a szakaszban már szintén exponenciális túlélési dinamika
érvényesül. A hangtér letisztulása, a kiülepedés miatt nem okoz nagymértékű
sejtvédő hatást a kavitációval szemben, mivel a kavitáció intenzív hangtérbeli
folyadékáramlást indukál, amely hatására a sejtek kavitációs buborékkal történő
találkozása biztosított, így folyamatosan megtörténik az inaktiválódás. Az 7. ábrán, a két különböző kiinduló
sejtkoncentrációjú szuszpenzió túlélési görbéi látszanak. Megfigyelhető, hogy a
két különböző sejtkoncentrációhoz, sőt a magasabb kiinduló koncentrációjú
szuszpenzióban kialakuló eltérő jelenségekhez is, különböző „D” értékek
tartoznak (2. táblázat). Az egyes jelenségek úgy hatnak, mintha nem ugyanazt a
kezelést kapná a két minta. Ez azért van, mivel a különböző sejtkoncentrációk
hatására más-más jelenségek jutnak érvényre a hangtérben, melyek a most
tárgyalt sejtkárosító hatáson túl egyéb hatásokat is kifejtenek a szuszpendált
részecskékre. Az alapanyag 5,6*109 /g kiinduló sejtszámú.
1. táblázat: túlélő sejtszámok
alakulása az idő függvényében
Kezelési idő (sec) |
0 |
15 |
30 |
45 |
60 |
75 |
90 |
105 |
120 |
135 |
150 |
180 |
200 |
240 |
270 |
280 |
Átl. túlélő sejtszám (%) 3,2 [g/l] |
80,25 |
30,5 |
14,8 |
7,25 |
3,75 |
1 |
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Átl. túlélő sejtszám (%) 7,04 [g/l] |
80 |
62 |
39,8 |
34,3 |
30,8 |
30,3 |
29 |
27,8 |
26,5 |
18,5 |
10,5 |
6,5 |
3,75 |
2 |
0,8 |
0 |
6. ábra: túlélő sejtszámok
alakulása az idő függvényében
7. ábra: a különböző
kiinduló koncentrációkhoz tartozó túlélési görbék
2. táblázat: tizedelődési idők
a különböző szuszpenzió koncentrációk és az eltérő hangtérbeli jelenségek
mellett
Kiinduló
szuszpenzió |
koncentráció |
logN |
Kialakult jelenség |
D |
(g/l) |
N (db/ml) |
|
|
(sec) |
3,2 |
1,792*107 |
7,25 |
Kavitáció |
44,05 |
7,04 |
3,942*107 |
7,59 |
Akusztikus áramlás |
140 |
|
1,516*107 |
7,18 |
Állóhullám |
433 |
|
1,304*107 |
7,11 |
Kavitáció |
99 |
Következtetések, javaslatok
Az ultrahangtérbeli
jelenségek tudatos megválasztásával tehát célirányos tevékenységet
folytathatunk. Azonban az ultrahang felhasználásának akár az előzőekben
ismertetett egyszerű sejtfeltárási felhasználási célhoz szükséges kísérleti
paraméterek nem megfelelő megválasztása a hangtérben nem kívánatos jelenségek
megjelenését eredményezheti, amelyek megnehezíthetik, vagy ellehetetleníthetik
az ultrahangos munkát, akár egy egyszerű kereskedelmi roncsolónál is. Az
ultrahangos munka alapvető követelménye kell, hogy legyen a jelenségcentrikus nézőpont,
még abban az esetben is, ha a kísérleti körülményeket nem lehet állandósítani.
Irodalomjegyzék
1.
Bíró,
I. (1976): Mikrobiológiai Gyakorlatok. ATE Mezőgazdaságtudományi Kar,
Tejgazdaságtani és Mikrobiológiai Tanszék. P.: 64.
2.
Blackshear,
P. L. – Blackshear, G. L. (1987): Mechanical hemolysis. In: Skalak, R. – Chien,
S. eds. Handbook of bioengineering. New Zork: McGraw-Hill, pp. 15.1-15.9.
3.
Brayman,
A. A. – Azadniv, M. – Miller, M. W. – Chen, X. (1994): Bubble recycling and
ultrasonic cell lysis in a stationary exposure vessel. J. Acoust. Soc. Am. Vol.
96. pp. 627-633.
4.
Deák,
T. (1997): Élelmiszeripari Mikrobiológia. Kertészeti és Élelmiszeripari
Egyetem, Tartósítóipari Kar. Pp.: 51-54.
5.
Eckart,
C. (1948): Phys. Rev. 73, p.68.
6.
Frizzel,
L. A. (1988): in Suslick, S. K. (1988): Ultrasound, Its Chemical, Phisical, and
Biological Effets. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim.
7.
Fry,
F. J. (1978): Ultrasound: Its Applications in Medicine and Biology. Elsevier
Scientific Publishing Company, Amsterdam-Oxford-New York.
8.
Horbenko,
I. G. (1977): Ultrahang a gépiparban. Műszaki Könyvkiadó, Budapest. p. 186.
9.
Gröschl,
M. – Trampler, F. – Benes, E. – Nowotny, H. (1999): Analysis os composite
resonators for ultrasonic micromanipulation and separation. Acustica – acta
acustica 85, Supplement 1, p. S92, as well as in Journal of Acoustical Society
of America Vol. 105, p. 1018, February 1999.
10.
Liebeskind,
D. – Bases, R. – Elequin, F. – Neubrot, S. – Leifer, R. – Goldberg, R. –
Koenigsberg, M. (1979): Diagnostic ultrasound: effects on the DNA and growth
patterns of animals cells. Radiology. Vol. 131, pp. 177-184.
11.
Loverock,
P. – ter Haar, G. (1991): Synergism between hyperthermia, ultrasound and gamma
irradiation. Ultrasound in Med & Biol., Vol. 17, pp.
607-612.
12.
Lőrincz,
A. – Neményi, M. (2001): Cell decrease by ultrasonic effect on yeast
(Saccharomyces cerevisiae) suspension and the limit concentration of
cavitation. Phisical Methods In Agriculture, Praha, Aug. 28-30.
13.
Miller,
M. W. – Miller, D. L. – Brayman, A. A. (1996): A review of in vitro bioeffects
of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound in
Med & Biol., Vol. 22, No. 9, pp.
1131-1154.
14.
Miller,
D. L. – Thomas, R. M. (1994): Cavitation dosimerty: estimates for single
bubbles in rotating-tube exposure system. Ultrasound in Med & Biol., Vol. 20, pp.
197-193.
15.
Suslick,
S. K. (1988): Ultrasound, Its Chemical, Phisical, and Biological Effets. VCH
Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim.
16.
Tar,
F. (1982): Ultrahangfizika. Kohó- és Gépipari Továbbképző és Módszertani
Intézet, Budapest.
17.
Tarnóczy,
T. (1963): Ultrahangok. Műszaki Könyvkiadó, Budapest. p.271.
18.
Thacker,
J. (1973): An approach the mechanism of killing cells in suspension by
ultrasound. Biochem. Biophis. Acta. 304, 240.
19.
Veit,
I. (1977): Műszaki Akusztika. Műszaki Könyvkiadó, Budapest. p.: 169.
20.
Walsh,
P. – Radel, S. - McLoughlin, A. J.
–Gherardini, L. – Benes, E. (1999): Evaluation of the effect of immobilisation
techniques and low intensity ultrasonic waves on brewer’s yeast cells. Poster
presentation, to be published in Proc. of the Ninth European Congress on
Biotechnology, Brussels, July 11th – 15th, 1999.