In vitro sejtfeltárás
hatékonyságát befolyásoló fizikai tényezők
LŐRINCZ, A. – NEMÉNYI, M.
Nyugat- Magyarországi
Egyetem
Mezőgazdaság- és
Élelmiszertudományi Kar, Mosonmagyaróvár
Agrárműszaki,
Élelmiszeripari és Környezettechnika Intézet
9200 Mosonmagyaróvár, Vár 2.
Tel.: 06-96-576-635
e-mail: lorincza@mtk.nyme.hu
A sejtszuszpenziók in vitro ultrahangos besugárzása
különböző intracelluláris sejtalkotó extrakciós és más kísérleti biológiai,
esetleg in vivo előkészítő céllal, már évtizedekkel ezelőtt magas szintre
jutott. A bonyolult biofizikai folyamatokra, az adott felhasználási célnak
megfelelő, a mai napig jól használható összefüggések születtek. A különböző
ipari és laboratóriumi felhasználási célú ultrahang besugárzási eljárások
azonban, az egyes rendszerek bonyolult biológiai, fizikai és kémiai felépítése
miatt, még tartogat meg nem oldott problémákat. Jól ismert tény, hogy a
besugárzás fizikai paraméterei, például a frekvencia, intenzitás, a hangtér
kialakítása, illetve a kezelt közeg fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságai,
e képen a hőmérséklet, sűrűség, oldott ion koncentráció, az oldott ion típus,
oldott gáz típus, oldott gáz mennyiség, kavitációs magok jelenléte, és egyéb
tényezők külön-külön milyen összefüggésekkel bírnak a besugárzásra, például a
kavitációs küszöbre. Azonban a gyakorlatban kezelendő különböző anyagok,
például az élelmiszerek, mint polidiszperz rendszerek, sajátosságaikat tekintve
egymástól az előzőekben felsorolt tulajdonságaikban alapvetően különbözhetnek,
sőt az egyes élelmiszerek minősége sem tekinthető folyamatosan állandónak. Ezért
a meghatározott céllal történő ultrahangos besugárzás hatásainak elméleti
meghatározását, a gyakorlati felhasználás szempontjából könnyen és
biztonságosan alkalmazható módszerekkel kell kiegészíteni. Ilyen lehet besugárzás alatt a
sejtpusztítási célú kavitáció detektálása audionális, vagy a szeparációs célú
állóhullám vizuális, vagy optikai detektálása, illetve magának a végeredménynek
a mérése. A kavitációs küszöb, illetve a haladó és az állóhullám kialakulása
egyazon közegben az intenzitás mellett, a gyakorlati eseteket figyelembe véve,
leginkább a diszpergált részecskék koncentrációjától és minőségétől függ. Ez az
elméleti, sőt a gyakorlati munkákban sincs kihangsúlyozva megfelelő súllyal. Az
elméleti munkákban a szemcsék, mint szóró centrumok szerepelnek, melyek a
síkhullámokat gömbhullámmá alakítják, illetve pontszerű hőforrásként működnek.
Azonban ha kiszámítjuk, milyen mértékű az energiaveszteség e miatt a
hangtérben, akkor sem tudhatjuk pontosan, milyen intenzitás szükséges a
megcélzott hatás küszöb kialakításához. Ezért van szükség jó indikátor
módszerekre a jelenségek felismerése céljából, valamint ezeknek a módszereknek
a hatásokkal történő biztonságos összeegyeztetésére az adott felhasználási
területen. A gyakorlatban egy-egy adott jelenség kihasználására különböző
tudományterületek fejlődtek ki, amilyen például a szonokémia, vagy a most
születő EuroUltraSonoSep Európai Uniós TMR hálózatban zajló kutatási projekt,
melynek célja a biotechnológiai emulzió disszociáció, és más diszperziók,
például sejt szuszpenziók ultrahangos szétválasztása, mely projektben több
kutatóintézet, kutatói team és egyetem vesz részt. A feltáró munka kapcsán azt
is fel kellett ismerni, hogy az egyes szakterületeken zajló ultrahangos munkák
egymásba nem mindig konvertálhatóak, amelyre jó példák lehetnek az ultrahangos
szeparáció és a sejtszerv extrakció, mivel e két alkalmazási terület céljai
homlokegyenest ellentétesek. Az első célja egy sejtekből álló tervszerű térbeli
rendszer megalkotása álló hullámok segítségével a sejt életképesség megőrzőse
mellett a haladó hullámok és a kavitáció kizárásával, a második célja viszont a
sejtek szétroncsolása, a kavitáció által, az állóhullám kizárásával. A probléma
nehézsége, hogy a két hatás egy hangtérben is könnyen létre jöhet akaratlagosan,
vagy nem megfelelően működtetett rendszer esetében véletlenszerűen is. Emiatt
nagy hibák és az ultrahang hatékonyságával kapcsolatos gyakori félreértések
származhatnak a kísérleti körülmények nem megfelelő megválasztásából, melyre jó
példa a kísérleti körülmények közül például csak a sejt szuszpenzió
koncentrációjának megváltoztatása miatt kialakuló sokféle ultrahang jelenség,
amelyek eltérő hatást fejtenek ki a sejtekre. Az eltérő jelenségek célirányos
kihasználásával azonban különböző feladatok végrehajtására nyílik mód.
Kísérleteink célja, hogy megfelelő elméleti és
gyakorlati háttér segítségével szelektív ultrahanghatást érjünk el, mégpedig
úgy, hogy a közeg bizonyos komponenseit inaktiváljuk, míg más komponenseket
pedig érintetlenül hagyunk. Ennek két elérhető módja mutatkozik. Az első,
amikor térben ultrahang hullámokkal szétválasztjuk egymástól a kérdéses
komponenseket fizikai tulajdonságaik alapján, és a nem kívánt komponenseket
kivezethetjük a rendszerből, illetve a helyszínen például kavitáció által
szétroncsolhatjuk azokat. A második pedig a közegben található egyes
komponensek eltérő érzékenységét használja ki az egyes ultrahang által
létrehozható jelenségekkel szemben. A kísérleteinkben optimális gyakorlati
felhasználhatóságú ultrahangos folyamatérzékelő detektálási módszereket
alkalmazunk, amelyek eredményeit a hullámjelenségek által okozott sejtroncsoló
hatáshoz viszonyítjuk a kezelési idő függvényében pékélesztő (Saccharomyces
cerevisiae) teszt mikroorganizmusra. Feltártuk a kölcsönhatását a
szuszpendált szemcsék hangtérbeli koncentrációjának a hangtérben kialakult
hullámjelenségekkel, valamint a kialakult hullámjelenségek hatását az adott
szuszpendált részecskékre a behatási idő függvényében.
Irodalmi
áttekintés
Tar et al. (1982) a hangtér a tér minden olyan
pontja, ahol a hanghullámokra jellemző, váltakozó nyomás lép fel. A hangtérben
kialakuló hullámtípusok a sugárzó típusától, a hangtér kialakításától, valamint
a hangtér fizikai paramétereitől függnek. Longitudinális hullám esetén a
hullámmozgást végző közeg sűrűsödései és ritkulásai a hullám terjedésének
irányában vannak, ami a gázokra és folyadékokra jellemző. Az állóhullám akkor
alakul ki, ha két azonos típusú, frekvenciájú és amplitúdójú, de ellentétes
irányú hullám találkozik, ez az interferencia jelenség. Az állóhullám úgy
keletkezik, hogy egy haladó hullám valamilyen akadályon visszaverődik és az
eredeti, valamint a visszavert hullám interferál. Ha egy irányba halad a
hullám, haladó hullámról van szó. A hangszóródás ott jelentkezik, ahol a
hullámok rugalmas közegbe ágyazott idegen testhez, akadályhoz érnek. A
hanghullámok minden anyagban frekvenciájuktól, a hullám típusától, a
hőmérséklettől, illetve az anyag tulajdonságaitól függő mértékben
adszorbeálódnak, a rezgési energia irreverzibilis hővé alakulása következtében.
Hobenko et al. (1977) szerint a hangtérben a hangnyalábot feloszthatjuk közel
térre, átmeneti tartományra és távoltérre. Az ultrahang közel tér (near
field) távolságát a kör alakú rezgőnél az alábbi képlettel fejezi ki:
Nkör = D2*f
/ 4*c = 0,25* (D2*f /c)
Ahol
(D) a rezgő átmérő [mm], (f) a frekvencia [Hz], (c) a hullám terjedési
sebessége [m/s]. A közel térben a hangnyomás ingadozás mértéke, a minimumok és
a maximumok helye eltérő.
Frizzel et al. (1988) szerint a kavitációs jelenség
olyan folyadékokban alakul ki, amelyek akusztikus zavarnak vannak kitéve akkor,
ha az akusztikus nyomás a hangciklus ritkulási fázisának folyamán a teljes
nyomást nézve lecsökken egy bizonyos küszöb, vagy határérték alá. Ez az akusztikus
nyomás amplitúdó küszöb számos fizikai paraméter függvénye, amelyek a közeg
állapotát írják le. Ezekbe bele tartozik a hangintenzitás, a frekvencia, a
hőmérséklet, a nyomás, az oldott gáz típusa, mennyisége, a viszkozitás, a közeg
előélete, a kavitációs magok típusa, mennyisége, az oldott ion koncentráció,
stb.
A kavitációnak
két típusa van, melyek közül az egyik a stabil kavitáció, amikor a buborék
számos hangcikluson keresztül oszcillál a közegben, illetve a másik a tranziens
kavitáció, amely azt jelenti, hogy a buborék néhány hangciklus alatt gyorsan
növekedik majd utána hevesen összeomlik. Veit et al. (1977) szerint a kavitáció
akusztikailag zajként jelentkezik, ami mikrofonnal felvehető és elemezhető. Fry et al. (1978) biofizikai
vizsgálatok során azt találták, hogy ultrahangos besugárzás alatt az
intracelluláris sejttestecskék egyenletesen pörögnek a sejtekkel együtt, ami az
ultrahangos forgató nyomaték következménye. A mikroáramlások, az akusztikai
határrétegekben indukálódnak, mint például a folyadék, és a szuszpendált
objektum közti határrétegben, ahol a váltakozó irányú áramlás eredményeként
erős turbulenciákként manifesztálódnak. A mikroáramlás fontos kapcsolatban van
a biológiai hatásokkal, ahol magas sebesség gradiens és nagy nyírófeszültség
jellemző, ami a határfelületi rétegekben keletkezik és a biológiai sejtek,
valamint a sejtszervek, makromolekulák roncsolódását, pusztulását, ill.
inaktiválódását okozza.
A biológiai anyagokban, mint minden anyagban
irreverzibilis folyamatok játszódnak le, melyek a hang energia folyamatos hővé
történő átalakulását okozzák, mely hőhatás szignifikáns az ultrahangok
biológiai hatásaival. A hőmérséklet emelkedésének ez a folyamata könnyen
elegendő a biológiai struktúrák és folyamatok megváltoztatásához. Az
intenzitás:
I = I0 * e –2αx
ahol
(I0) [W/cm2] vagy [dB] a kiindulási intenzitás, (I) az
aktuális intenzitás [W/cm2] vagy [dB], (α) az abszorpciós
koefficiens [Np/cm] = 8,7 [dB/cm], (x) pedig az irány. A hőképződés egységnyi
térfogatra pedig:
qv = 2αI.
Eckart
et al. (1948) szerint a kvarc szél, az ultrahang globális áramlása térben, a
sugárzótól a közegbe a sugárzás irányában. Nemlineáris mechanikai hatás tehát
az akusztikai áramlás, mely az ultrahang hullámokkal besugárzott folyadékokban
jön létre, amelynek kapcsán a folyadékban lévő szuszpendált részecskék a
folyadékkal együtt mozognak, miközben súrlódnak. Suslick et al (1988)
szerint a sugárzási erő azt jelenti, hogy ultrahang besugárzás alatt a
hangtérben minden besugárzott objektumra adott nagyságú és irányú erő hat,
melyet a sugárzó intenzitása és a tér paraméterei befolyásolnak. Thacker et al. (1973) a haploid és diploid Saccharomyces
cerevisiae pékélesztő sejtek túlélésében eltéréseket tapasztaltak. Ezzel
kapcsolatban nem szinkronizált populációk vizsgálata javasolt, a sejtek eltérő
kavitációs érzékenysége miatt. A kapott túlélési görbék több szakasszal
rendelkezhetnek lefutásukban. A kavitációs határon dolgozó kutatók a pusztulási
arányt az egyszerűség kedvéért állandó exponenciális lefutásúra veszik fel. Miller et al. (1996)
szerint a sejt szuszpenzióban ultrahang hatására kialakuló nem termikus
folyamatok legfontosabbika a kavitáció, melynek mindkét formája a biológiai
hatások széles skáláját okozza. Miller és Thomas (1994) szerint a hidrogén
peroxid és egyéb szonokemikáliák genetikai, biokémiai hatásaihoz adódik hozzá a
kavitáció erőteljes mechanikai roncsoló hatása. Loverock és ter Haar (1991)
kijelentik, hogy a sejtkoncentráció fontos tényezője az in vitro szonolízisnek,
mégpedig, a magas koncentrációknál a szonolízis kisebb mérvű. Liebeskind et al. (1979) szerint az
ultrahang hatásai a besugárzást túlélő sejtek között lehet struktúra-,
funkcióváltozás, vagy akár az örökítő anyagra, a DNS-re gyakorolt hatások,
melynek kapcsán DNS szál törés, aberráció következhet be. Brayman et al. (1994)
szerint a nagyobb átmérőjű sejtek, kavitációra vonatkozó nagyobb érzékenysége
azzal magyarázható, hogy a nagyobb sejt nagyobb valószínűséggel találkozik a
kavitációs buborékokkal. Blackshear és Blackshear (1987) szerint azonban
az ok abban áll, hogy a kisebb sejtek sejtfalának szétszakításához nagyobb
nyíróerő szükséges. Göschl et
al. (1999) és munkatársai kijelentik, hogy a kis méretű szuszpendált
részecskék manipulálására, irányítására alkalmas rezonátorok legkevesebb négy
összetevőből kell, hogy álljanak. Ezek a piezoelektromos transzdúcer, a hordozó
edény (üvegedény), a folyadék (szuszpenzió) és az akusztikus reflektor. Walsch
et al. (1999) és munkatársai a Saccharomyces cerevisiae sörélesztő
ultrahangos immobilizációjának biológiai hatásait vizsgálták. A tanulmányok
kimutatták, hogy az élő sejtszám csökkenés, valamint a sejt osztódási
képességének a csökkenése (elvesztése) a fő hatásai a terjedő (haladó)
ultrahang hullámoknak az élesztő sejtek fiziológiájára. Az állóhullámú térben
nem voltak szignifikáns károsító hatások. Az eredmények metilénkék vitális
festésen alapultak. Az élesztő sejtek térbeli rendszerét eredményezi az
állóhullámú tér, ami megvédi a sejteket a károsodástól. Tarnóczy et al. (1963)
korai munkájában leírja, hogy az ultrahang mechanikai hatására az állóhullám
térben a szilárd részecskék nagyobb tömegekbe összecsapódnak a nyomási
csomósíkokba, ez alatt súlyuk megnövekszik, a nagyobb súlyú darabok pedig nem
maradnak lebegő állapotban, hanem a nehézségi erő hatására kiülepednek. Lőrincz
et al. (2001) in vitro ultrahangos besugárzással szemben a sejtek, még egy
populáción belül is eltérő érzékenységűek, ami számos morfológiai és genetikai
tényező függvénye. Ezt az ismeretet egyértelműen ki lehet használni a szelektív
kezeléseknél. Deák et al. (1997) szerint a környezeti tényezőkön keresztül ható
beavatkozások, melyek a mikroorganizmusok pusztulását okozzák, a vizsgálatok
többségének eredményei szerint exponenciális lefutásúak. Továbbá kinetikailag a
sejtpopulációk pusztulásának időbeli lefutása az egysejtű mikroorganizmusok
szaporodásához hasonlóan, az elsőrendű kémiai reakciók analógiájára írható le:
dN / dt = -k * N.
Az
egyenletben az [N] a túlélő sejtszám, melynek változása [t] idő alatt arányos a
mindenkori sejtszámmal, és ahol a [k] arányossági tényező a pusztulási
sebességi együttható, vagyis a fajlagos pusztulási sebesség. A fenti
differenciál egyenletet N0 (kezdeti sejtszám t0
időpillanatban) és Nt (túlélő sejtszám t időpillanatban) határok
közt integrálva, a mikrobapopulációk pusztulásának alapegyenletét kapjuk:
Nt = N0
* e –k(t-t0)
Amely
alakilag azonos az exponenciális szaporodás egyenletével, csak az együttható negatív
előjelű. Az egyenletet logaritmálva, a túlélési görbe egyenletét kapjuk:
log Nt = log N0
–(k/2,303) * (t-t0)
amiből
látszik, hogy a túlélő sejtek logaritmusát az időben ábrázolva egyenest kapunk,
melynek meredeksége a pusztulási sebességi együtthatóval arányos, melyet az
egyenletből kifejezve:
k = ((2,303 / (t-t0))
* log (N0 / Nt)
A
kezdeti és a t időben mért végső sejtszámból a [k] értéke meghatározható. Ha a
túlélési görbe egyenletében szereplő t-t0 időt úgy definiáljuk, mint
azt az időtartamot, mely alatt a túlélő sejtszám a tizedére csökken, akkor a
tizedelődési idő [D] fogalmához jutunk.
Ha t-t0 = D és Nt = 0,1 * N0, akkor:
k = 2,303 / D , vagy D =
2,303 / k
A
tizedelési idő a mikrobapopuláció ellenállásának (rezisztenciájának) percekben
kifejezett mértéke. Adott behatás mellett, minden [D] időtartam alatt a sejtek
10 %-a marad életben, 90 %-a elpusztul, tehát a pusztulási arány állandó és
független a kezdeti sejtszámtól. Amennyiben a populáció kiindulási sejtszámának
tizedénél nagyobb mértékű pusztulási arányt akarunk elérni, akkor a többségi
pusztulási időt [t] kell meghatározni. Ha az
exponenciális pusztulási kinetika érvényesül és ismerjük a tizedelődési időt,
akkor a mikrobaszám tetszőleges mértékű csökkentéséhez szükséges többségi
pusztulási időt, bármely kezdeti sejtszám esetére kiszámolhatjuk:
t = D * (log N0 –
log Nt)
Ezzel
meghatározhatjuk a kívánt mértékű mikrobaszám csökkentéséhez szükséges kezelési
időt állandó pusztító dózis alkalmazása mellett. Bíró et al. (1976) szerint a
mikroorganizmusok életképességének meghatározására a legrégibb és legegyszerűbb
eljárás a metilénkékes festés. Főleg az élesztők esetében elterjedt a módszer,
melynek alapja, hogy ha az élő és holt sejtekből álló szuszpenziót híg
metilénkékkel hozzuk össze, akkor a holt sejtek rögtön kékre festődnek, míg az
élők a festék dehidrogenázokkal történő redukálása miatt, nem színeződnek. Az
utóbbiak számarányának és az összes csíraszámnak ismeretében az élő csíraszám
meghatározható.