Komplex ultrahang-rendszer értékelése, a besugárzás miatt kialakult
mikroorganizmus-csíraszám csökkentő hatás alapján
NEMÉNYI,
M. - LőRINCZ, A.
Nyugat-Magyarországi Egyetem
Mezőgazdaság- és
Élelmiszertudományi Kar, Mosonmagyaróvár
Agrárműszaki, Élelmiszeripari
és Környezettechnikai Intézet
9200-Mosonmagyaróvár,
Vár 2.
Tel.,/06
96 215 911 / 209
e-mail: lorincza@mtk.nyme.hu
1. Bevezetés
Az
élelmiszereink minőségét veszélyeztető ágensek közül a mikroorganizmusok, mint
ételfertőzést, illetve bizonyos körülmények között ételmérgezést előidéző
szervezetek az élen járnak. Sok technológiai megoldás áll a modern
élelmiszeripar rendelkezésére, hogy ezt a veszélyforrást a minimálisra
csökkentse. Ezek a megoldások azonban a mai élelmiszerekkel szemben támasztott
követelményeknek nem minden esetben felelnek meg. Erre példa, hogy a
legáltalánosabban alkalmazott hőkezelés során egyes vitaminok
inaktiválódhatnak, vagy a fehérjék denaturálódhatnak, így az adott élelmiszer
biológiai értéke csökkenhet. Természetesen vannak az egyes élelmiszerekre
speciálisan alkalmazott precíziós csíraszám csökkentési eljárások is, amelyek
bekerülése jóval nagyobb költségráfordítást igényel a hagyományos módszerekkel
szemben. Azonban az ebből származó piaci versenyhelyzet előny miatt az
élelmiszeriparban reményeink szerint ez utóbbi törekvés kerül előtérbe. Az
általunk vizsgált ultrahangos csírátlanítási módszer nem újdonság az
élelmiszeriparban. A hetvenes évek népélelmezési törekvései természetesen a
módszer alkalmatlanságát bizonyították. A mai társadalmi fogyasztói igények
azonban lehetővé teszik kiváló minőségű élelmiszerek előállítását. Ezen
gondolatok alapján végeztük el kísérleteinket, melyek eredményeképpen tovább
bízhatunk a módszer alkalmazhatóságában.
Thacker1, vizsgálta a haploid és
diploid pékélesztő (Saccharomyces cerevisiae) sejtek túlélését, és
eltéréseket tapasztalt. Méghozzá ezzel kapcsolatban nem szinkronizált populációk
vizsgálatát javasolja, a sejtek eltérő kavitációs érzékenysége miatt, ezáltal a
kapott túlélési görbék nem egy, hanem több fázisúak lesznek lefutásukban.
Emiatt az eredményei bizonyos eltérést mutattak a szokványos exponenciális
túlélési görbétől, habár a kavitációs határon dolgozó kutatók a pusztulási
arányt az egyszerűség kedvéért állandó exponenciális lefutásúra veszik. Hughes2,
szintén élesztő sejteket tárt fel kavitáció segítségével és arra a
megállapításra jutott, hogy a kavitáció során keletkező szabad gyökök kevésbé
járulnak hozzá a sejtek feltáródásához, mint a kavitáció mechanikai roncsoló
hatásai. Hradzia3, ezzel kapcsolatosan azt állítja, hogy a
sejt szuszpenziókban keletkező szabadgyökök és más anyagok által kiváltott
szonokémiai hatások a sejtek életképességének mindössze 2-3 %-os csökkenését
okozzák. Thacker4, vizsgált továbbá négy genetikai
rendszerhez tartozó élesztő sejteket, az ultrahang mutagén hatásának
tekintetében. A mitokondriális DNS-ben legtöbbször mutációs hatás volt kimutatható,
azon a frekvencián és intenzitáson, ahol kavitáció alakult ki. A mutagén hatás
pedig növekedett a hőmérséklet emelkedésével. D.E Hughes és W.L. Nyborg5,
Vizsgálták az Escherichia coli baktériumok ultrahang általi pusztulását,
és azt tapasztalták, hogy stabil kavitáció esetében is megtörtént a sejtek
pusztulása, így ez alapján azt állítják, hogy a tranziens, összeomló típusú
kavitáció nem elengedhetetlen a sejtek széttöredezéséhez. Ter Haar6
szerint, az ultrahangnak alávetett sejtek esetében, amelyeknél hőmérséklet
növekedés lép fel és amely sejtek nem pusztulnak el rögtön, ott
szaporodóképesség vesztés lép fel. Chapmann7, kimutatta, hogy
az ultrahang képes szubletális változásokat indukálni a plazmamembránban
például a kálium anyagforgalom azonnali csökkenésével.
Kísérleti teszt
mikroorganizmusként 1 g pékélesztőt (Saccharomyces cerevisiae)
szuszpendáltattunk 500 ml vízben, így a sejtkoncentráció 2*106/ml. A
jobb detektálhatóság miatt a szuszpenzióba egy csepp metilén kék oldatot
cseppentettünk ez így még nem befolyásolta a mikroorganizmus vitalitását. Ezt a
szuszpenziót folyadékáramoltatásos rendszerbe töltöttük perisztaltikus pumpa
segítségével. A folyadékáramoltatásos rendszert azért alkalmazunk, mert a
különböző céllal alkalmazott szerkezeti egységeket lehetetlen egy térben
elhelyezni. A folyadékot a betöltés és a rendszer rövidre zárása után a
perisztaltikus pumpa keringeti a különböző szerkezeti egységek között. A
folyadékot ezek után nem közvetlenül, hanem speciálisan erre a célra
kialakított átfolyó küvetták által kezelhetjük, illetve vizsgálhatjuk. Így a
szuszpenzió speciálisan kialakított ultrahangos kezelő küvettákon keresztül
csatlakozik az ultrahangos rendszerhez, ahol a tulajdonképpeni kezelés történik
adott frekvencián és teljesítményen. Majd a folyadék tovább haladva a
detektorként alkalmazott biológiai mikroszkópban elhelyezett detektorcellába
jut, ahonnan a kép CCD kamerán át a számítógépes archiváló rendszerbe, illetve
egy speciális álszín-kódoló nevű műszerbe jut. A műszer a szürkeségi fokok
alapján képes különbséget tenni az objektumok között, és ezt területegységre
vonatkoztatja. A területegységeket két pontos kalibráció alapján is képes
állandóan nyomon kísérni és jelen esetben a sejtpusztulás mértékét az előzetesen
kalibrált 100%-os értékhez képest kijelezni, valamint ezt az értéket
feszültségjellé alakítva egy plotterhez irányítani, ahol idő függvényében
görbét kapunk, amely alapján a mindenkori sejtkoncentrációt kísérhetjük nyomon.
A rendszerhez tartozik még egy termosztát, amely állandó hőmérsékletet
biztosít. A rendszerek egymáshoz kapcsolódnak. Mivel az analitikai egység még
fejlesztési stádiumban van, a kapott sejtszám értékek a folyadékrendszer
megcsapoló csonkján időegységenként vett minta sejtszámának immerziós objektív
alatti leszámolásával kerülnek meghatározásra. Sejtnek minden esetben az ép
sejtfallal rendelkező vitalitást tükröző sejtek minősülnek. A kezeléseket
0,8-1MHz frekvencia mellett 7,5; 9,6; 10,5 és 12 W/cm2
teljesítményeken végeztük és meghatározott időpontokban mintát vettünk a
szuszpenzióból, amit kiértékeltünk az immerziós objektív alatt látható átlagos
sejtszámok alapján.
A mintavételek sejtszám
alakulása százalékos arányban az 1. táblázatból, és az 1. ábrából látszik.
Láthatjuk hogy a nagyobb teljesítmények alkalmazása mellett az idő függvényében
drasztikusabb sejtpusztulások figyelhetők meg. Hogy egy modellképletet
kaphassunk, a rendszert 22 db/látótér kiinduló sejtszámokra korrigáltuk (2.
táblázat) és ezeket az értékeket pontdiagramban ábrázoltuk. A pontokra
különböző trendfüggvényeket helyezve (2. ábra) a logaritmusos trendfüggvények
mutatták a legmagasabb szintű korrelációt. A függvények addíciós és szorzó
tényezőire trend függvényeket helyezve, végeredményképpen a 3. táblázatban
látható képletet kaptuk. Ennek segítségével kiszámítható, hogy adott kiinduló
sejtszámú anyagot mekkora teljesítményű
ultrahanggal kell kezelni, hogy a sejtszám a kívánt értékre csökkenjen adott
idő elteltével, vagy éppen egy állandó teljesítményű ultrahang behatás idejét lehet meghatározni a szükséges
sejtszám eléréséhez. Természetesen ezek az értékek a mi rendszerünkre
vonatkoznak, és általános alkalmazhatóságához korrekciós tényezőt kell
alkalmazni az aktuális viszonyoknak megfelelően. Végül az 3. ábrán a 7,5 W/cm2
teljesítményű kezelés visszahelyettesítését mutatja, azt hogy a képlet a
valóságos kiinduló sejtszámhoz képest soha nem mutat 15%-nál nagyobb eltérést.
1, táblázat: Látóterenkénti
sejtszám alakulása az idő függvényében a kiindulási sejtszámot 100%-ban meg határozva
|
Immerziós |
látóterenkénti |
sejtszám |
(%) |
kezelési idő (perc) |
7,5W/cm2 |
9,6W/cm2 |
10,5W/cm2 |
12W/cm2 |
0 |
100 |
100 |
100 |
100 |
15 |
65,21 |
63,63 |
66,66 |
56 |
30 |
56,552 |
50 |
40 |
44 |
60 |
52,17 |
40,9 |
20 |
16 |
105 |
39,13 |
22,72 |
10 |
8 |
165 |
32,6 |
13,63 |
6,66 |
4 |
250 |
21,73 |
3,63 |
2 |
0,8 |
265 |
19,56 |
2,27 |
0 |
|
285 |
17,39 |
0,9 |
|
|
405 |
1,7 |
|
|
|
1. ábra: Élesztő sejtszám változása az idő
függvényében a különböző teljesítményű ultrahang kezelések hatására
Az immerziós látótérben számlált sejtek számának 22
darabra történő korrekciója a logaritmusos trendfüggvény érdekében |
||||||
|
7,5 |
9,6 |
10,5 |
12,0 |
4,0 |
40,0 |
1 |
22,0 |
22,0 |
22,0 |
22,0 |
24,4 |
20,9 |
15 |
14,3 |
14,0 |
14,7 |
12,3 |
18,5 |
2,9 |
30 |
12,4 |
11,0 |
8,8 |
9,7 |
16,9 |
-1,8 |
60 |
11,5 |
9,0 |
4,4 |
3,5 |
15,4 |
-6,4 |
105 |
8,6 |
5,0 |
2,2 |
1,8 |
14,2 |
-10,1 |
165 |
7,2 |
3,0 |
1,5 |
0,9 |
13,2 |
-13,1 |
250 |
4,8 |
0,8 |
0,4 |
0,2 |
12,2 |
-15,9 |
265 |
4,3 |
0,5 |
|
|
12,1 |
-16,3 |
285 |
3,8 |
0,2 |
|
|
12,0 |
-16,8 |
405 |
0,4 |
|
|
|
11,2 |
-19,1 |
2.
ábra: 22 db/ látótér sejtszámra korrigált kiindulási sejtszám pontdiagrammja,
illetve az alap trendfüggvények
3.
táblázat: a végső összefüggés az ultrahangos kezelés modellezésére
y=a*lnx0+b
(x0=idő, min) |
a=-1.9376*lnx1+0.4753
(x1=teljesítmény, W/cm2) |
b=-1.5277*lnx1+26.567
(X1=teljesítmény, W/cm2) |
3.
ábra: a valós és a képlet alapján számított értékek egymásra vetítése
Az
ultrahangos kezelés nagy reményeket nyújt a precíziós fizikai
élelmiszerkezelések csoportjában. A jövőben a mikrobiális szelektivitás
vizsgálata, a koncentráció és hőmérséklet függés tanulmányozása a célunk.
1.
Thacker,
J. (1973): An approach the mechanism of killing cells in suspension by
ultrasound. Biochem. Biophis. Acta. 304, 240.
2.
Hughes,
D. E. (1961): J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng., 3. p. 405.
3.
Hrazdira,
I. – Skorpikova, J. – Dolnikova, M. –Janicsh, R. – Mornstein, V. (1998): The
combined effect of ultrasound and cytostatic treatment on the cytoskeleton of
HeLa cells. Folia Biol, 44 (Suppl.): S 14.
4.
Thacker,
J. (1974): Brit. J. Radiol. 47, p.130.
5.
Hughes,
D. E. and Nyborg, W. L. (1962): Cell disruption by ultrasound. Science,
38:108-114s
6.
ter
Haar, G. R. – Straford, I. J. – Hill, C. R. (1980): Br. J. Radiol. 53, 784.
7.
Chapman,
I. V. (1974): Br. J. Radiol. 47, 411.